HCMEC-D3細(xì)胞，人永生化腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

貼壁細(xì)胞參考：

一. 收貨后消毒靜置待細(xì)胞全部穩(wěn)定后拍照。棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

二. T25瓶加入0.25％EDTA胰蛋白酶1-2ml于培養(yǎng)瓶中震蕩混勻，如果屬于貼壁不牢固的細(xì)胞很容易脫落的就培養(yǎng)箱外面消化震蕩等脫落90%以上終止消化，一般小于1分鐘以內(nèi)，甚至不加胰酶有部分貼壁非常不牢固的細(xì)胞也會(huì)自然震蕩脫落。如果是貼壁牢固的細(xì)胞則置于37℃培養(yǎng)箱中消化提高效率，每40-50秒拿出培養(yǎng)箱震蕩幫助細(xì)胞脫落，如果脫落90%以上則對(duì)應(yīng)3-6ml含有10%血清的完全培養(yǎng)基終止徹底，以防胰酶殘留。如果貼壁非常牢固的細(xì)胞，脫落的比例比較低，也不超過2分鐘后終止消化徹底，再加入1ml完全培養(yǎng)基讓細(xì)胞緩沖后再過2分鐘進(jìn)行二次消化，反復(fù)分步消化以降低單次消化時(shí)長，減少刺激，保護(hù)細(xì)胞膜。或采用刮產(chǎn)刮細(xì)胞的方式處理也可以。總歸原則是達(dá)到消化目的的同時(shí)減少細(xì)胞膜受到的損傷越小越好。

三.消化完成后輕輕吹勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶/6cm培養(yǎng)皿中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。期間多的細(xì)胞一定保存多份細(xì)胞凍存管備種。

懸浮細(xì)胞參考：

大多數(shù)懸浮細(xì)胞對(duì)于環(huán)境比較敏感，建議一直維持高密度生長，一般情況下細(xì)胞密度維持在1×10 5到1×10 6個(gè)/mL（不同細(xì)胞對(duì)密度要求不同）。如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中800-1000rpm，離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例（首次可以1:1分瓶）分到新T25瓶中，添加5-6ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:4的比例進(jìn)行。大多數(shù)血液類相關(guān)的懸浮細(xì)胞受運(yùn)輸影響比較大，會(huì)出現(xiàn)一批死細(xì)胞，如果因此密度降低了，可以離心后轉(zhuǎn)移至T25瓶中豎著培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加5ml 以提高總體密度，隔一天后觀察密度可以的話再補(bǔ)液3ml完全培養(yǎng)基后T25瓶放倒，等沉淀穩(wěn)定后觀察細(xì)胞密度，持續(xù)添加培養(yǎng)基等密度上升足夠傳代為止。