一.消毒靜置等細(xì)胞穩(wěn)定后拍照 100X 和 200X。棄去培養(yǎng)上清,用 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次并吸走。
二. T25 瓶加入 0.25%EDTA 胰蛋白酶 1-2ml 于培養(yǎng)瓶中震蕩混勻,如果屬于貼壁不牢固的細(xì)胞很容易脫落的就
培養(yǎng)箱外面消化震蕩待脫落90%以上終止消化,一般小于1分鐘以內(nèi),甚至不加胰酶有部分貼壁非常不牢固的細(xì)胞也會
自然震蕩脫落。如果是貼壁牢固的細(xì)胞則置于37℃培養(yǎng)箱中消化提高效率,每40-50秒拿出培養(yǎng)箱震蕩幫助細(xì)胞脫落,
如脫落90%以上則對應(yīng)3-6ml含有10%血清的完全培養(yǎng)基終止徹底,以防胰酶殘留損傷細(xì)胞。如果貼壁非常牢固的細(xì)胞,
脫落的比例比較低,也不超過2分鐘后終止消化徹底,再加入1ml完全培養(yǎng)基讓細(xì)胞緩沖后再過2分鐘進(jìn)行二次消化,反
復(fù)分步消化以降低單次消化時長,減少刺激,保護(hù)細(xì)胞膜。或采用刮產(chǎn)刮細(xì)胞的方式處理也可以。總歸原則是達(dá)到消化
目的的同時減少細(xì)胞膜受到的損傷越小越好。
三.消化完成后輕輕吹勻后吸出,在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液
按1:2的比例分到新T25瓶/6cm培養(yǎng)皿中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,
后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2和以上比例進(jìn)行,具體以實(shí)際細(xì)胞密度決定。期間多的細(xì)胞一定保存多份細(xì)胞凍存管備種。