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    HAKATA NK 擴增試劑盒(含培養基)操作步驟 1L體驗版

    NK 細胞培養標準操作方案

    (1L 體系版本)


     

    為了能獲得穩定可靠的結果,請嚴格按照以下所述步驟進行操作,并使用我們推薦的實驗耗材及試劑。本試劑盒包含四種刺激組分(NK Cell Grower1~4),每管體積為500 μl,建議每管組分拿出靜置后再加入到培養基中,并用培養基潤洗管子,以確保每管所有組分都能加入到培養基中。請認真閱讀說明書配置每種擴增液!

    【實驗材料】

    NK Cell Culture Medium(1000 ml)

    NK Cell Grower 1(500 μl) NK Cell Grower 2(500 μl) NK Cell Grower 3(500 μl) NK Cell Grower 4(500 μl)

    懸浮細胞專用細胞培養瓶(T25、T75、T175)(透氣蓋培養瓶,推薦康寧品牌) 懸浮細胞專用培養袋

    淋巴細胞分離液

    無菌生理鹽水或PBS

    【實驗操作方案】

    所有的工作必須在無菌室中進行,請嚴格遵守無菌操作規范,使用無菌耗材。

    1、培養瓶包被

    (1) T-25 cm2 懸浮培養瓶中,加入3.5 ml PBS 和500 μl NK Cell Grower 1;

    (2) 輕輕搖晃,使溶液在培養瓶瓶底擴散,鋪滿瓶底;

    (3) 37℃培養箱靜置2 h 或在4℃靜置過夜;

    (4) 移除包被溶液,用 5 ml PBS 潤洗瓶底 1 (請勿吹打瓶底),洗過的培養瓶要立即使用。

    2、血液分離

    (1) 采集 20 ml 外周血于抗凝管(務必用肝素抗凝管),800g,15 min 室溫離心;


     

    (2) 自體血漿制備:取上清血漿,置于水浴鍋中 56℃,滅活 30 min  1100g,15 min 室溫離心,用移液管將上清轉移至新的 15 ml 管內4℃保存備用;

    (3) 取上述離心后下部細胞成分,加 PBS  20 ml,混勻,加到 2 個裝有 10 ml 醫療級人淋巴細胞分離液的 50 ml 離心管中,室溫下, 500g 離心 30 min,慢升慢降(加速度 2,減速度 0);

    (4) 離心后,血液被分為 4 層,由血漿(上層)、血漿和分離液之間的單個核細胞(第 2

    )、分離液(第 3 層)和紅細胞層(底層)構成。

    3、制備PBMC

    (1) 用吸管將第 2 層單個核細胞收集至新的離心管;

    (2) 加入 40 ml PBS 洗滌細胞懸液300g 離心 8 min;

    (3) 棄去上清液,再加入 40 ml PBS 洗滌細胞懸液300g 離心 8 min。

    (4) 棄去上清液,加入 20 ml NK Cell Culture Medium 稀釋細胞懸液,混勻,取 100 μl 懸液細胞計數,余下懸液 300g 離心 8 min。

    注:整套試劑可激活2-2.5*107PBMC,多余細胞可以棄去。

    4、NK 細胞擴增

    (1) Day0,配置NK細胞擴增液A:將全部的NK Cell Grower 2(500 μl)加入到10 ml NK Cell Culture Medium 中,加入1 ml滅活后的自體血漿。用該擴增液重懸將上述細胞到2~2.5*106/ml(該套試劑盒中只能配置10 ml擴增液A,即重懸2~2.5*107 細胞,因此多余細胞在上述計數后可以棄去)

    (2) 在已包被的T25培養瓶中,加入以上細胞懸浮液(以8 ml最合適,即起始細胞總數為1.6~2*107),請沿培養瓶側壁加入細胞,動作需輕柔,請勿直接吹打培養瓶底;

    (3)5% CO2、37℃培養3 天(在此期間請勿移動細胞,整個培養以靜置為主);

    (4) Day3,配置NK細胞擴增液B:將全部的NK Cell Grower 3(500 μl)加入到130 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打T25培養瓶中的細胞,將細胞懸液全部轉入T75培養瓶內,加入15 ml NK細胞擴增液B(剩余擴增液B2-8℃保存) 同時補加1.5 ml滅活后的自體血漿


     

    (5)  Day5,用移液管輕輕吹打細胞,取細胞進行計數,加入約30 ml NK細胞擴增液BT75培養瓶內,同時補加1.5 ml滅活后的自體血漿,使細胞密度保持在1*106/ml左右;

    (6) Day7,用移液管輕輕吹打細胞,將細胞懸液全部轉入T175培養瓶內,加入剩余的

    NK細胞擴增液B和剩余的滅活自體血漿

    (7) Day9,配置NK細胞擴增液C:將全部的NK Cell Grower 4(500 μl)加入到800 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打細胞,將細胞懸液轉入培養袋內, 視細胞生長狀態,補加200~250 ml NK細胞擴增液C(剩余擴增液C放2-8℃保存)

    (8) Day11,向培養袋內補加剩余的NK細胞擴增液C

    (9) Day14,鑒定細胞,同時取樣檢測真菌、細菌、支原體、內毒素等指標。

    注:所有培養液使用前需先預溫,避免低溫對NK細胞活化的影響!

    5、細胞收集

    (1) 經過14 天的培養,將細胞懸浮液從培養袋,轉入大型的離心瓶,用離心機以600g 離心10 min,分離細胞和培養基;

    (2) 小心地移去上清液,用含有0.1%人類血清白蛋白的生理鹽水(0.1%HSA 生理鹽水) 懸浮所有的細胞沉淀物,收集到一個離心瓶中。重復離心,清洗細胞3 次;

    (3) 收集細胞,用適量含有1%人類血清白蛋白的生理鹽水重懸細胞,通過一次性細胞篩(200)過濾,收集并注入含有1%人類血清白蛋白的生理鹽水回輸液中,總量為100~200 ml。封裝好后送病房,同時留樣封存以備日后檢測。

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    日期:2024-10-28

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    日期:2024-10-31

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